Estudio in vivo del mecanismo de activación de la Proteína Quinasa dependiente de cAMP

Portela, Paula

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Estudio in vivo del mecanismo de activación de la Proteína Quinasa dependiente de cAMP
Autor:	Portela, Paula
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Publicación en la Web:	2023-05-09
Fecha de defensa:	2005
Fecha en portada:	2005
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Químicas
Director:	Moreno, Silvia
Director Asistente:	Rossi, Silvia
Idioma:	Español
Palabras clave:	PKA; ACTIVACION; LEVADURAS; SUSTRATO; GLUCOSA; FOSFORILACION; PIRUVATO QUINASAPKA; ACTIVATION; YEAST; SUBSTRATE; GLUCOSE; PHOPHORYLATION; PYRUVATE KINASE
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3799_Portela
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3799_Portela.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3799_Portela
Ubicación:	Dep.QUI 003799
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Portela, Paula. (2005). Estudio in vivo del mecanismo de activación de la Proteína Quinasa dependiente de cAMP. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3799_Portela

Resumen:

La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) es la enzima mejor caracterizada de la familia de las proteínas quinasas que fosforilan residuos serina/treonina. La fosforilación de proteínas blanco es crítica para la regulación de varios procesos celulares, incluyendo metabolismo, expresión génica, crecimiento y muerte celular. Actualmente, no existe un modelo adecuado que permita explicar la variedad de respuesta que genera la vía cAMPPKA como consecuencia de la acción de drogas diferentes o diversos estímulos del medio ambiente, que actúan estimulando la vía del cAMP. Varios mecanismos controlan la activación espacio-temporal y la especificidad de la respuesta de la PKA. El objetivo general de esta tesis es contribuir a un mejor conocimiento del mecanismo de activación in vivo de la PKA. Para este propósito, hemos usado Saccharomyces cerevisiae como modelo experimental. En primer término, hemos evaluado si la determinación de la actividad PKA empleando células permeabilizadas puede ser un buen indicador de la actividad quinasa en células intactas. En segundo término hemos determinado la actividad in vivo de la PKA, y el cambio en el estado de fosforilación de la subunidad catalítica, durante el aumento de cAMP intracelular evocado por un estímulo extracelular (agregado de glucosa a células crecidas en glicerol). Finalmente, hemos caracterizado a la enzima piruvato quinasa 1 (Pyk1) como sustrato de PKA, y evaluamos sus propiedades cinéticas. De los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis, concluimos que el uso de células permeabilizadas de levaduras es el método mas apropiado para seguir la activación in vivo de la PKA. Por primera vez describimos la fosforilación reversible y dinámica de la subunidad catalítica. Se puede considerar a la fosforilación de la subunidad catalítica como un nuevo mecanismo de control, preciso y reversible, de la actividad PKA en respuesta a las condiciones del medio ambiente. Finalmente, experimentos preliminares con Pyk1 indican que la especificidad del sustrato y su capacidad de participar en el proceso de activación de la PKA depende de la naturaleza estructural de éste.

Abstract:

The cAMP-dependent protein kinase (PKA) is the most well-characterized member of the serine/threonine protein kinase family. Phosphorylation of its targets is known to be critical for regulating a multitude of cellular processes including metabolism, gene expression, growth and cell death. There are no adequate models, at present, suitable for explaining the variety of responses displayed by the cAMP-PKA system as a consequence of the action of different drugs or several environmental stimuli, that are known to act activating the same cAMP pathway. Several mechanisms control the spatio-temporal activation and specificity of the PKA response. The general aim of this thesis is to contribute to a better understanding of the in vivo mechanism of PKA activation. For this purpose we have used Saccharomyces cerevisiae as model. In a first stage, we have evaluated whether measurement of PKA activity in permeabilised yeast cells can give a good indication of the PKA activity in intact cells. In a second stage, we have measured a transient change in the in vivo PKA activity, along a cAMP peak produced by an extracellular stimulus (glucose addition to glycerol-growing cells) as well as a change in the phosphorylation state of its catalytic subunit following PKA activation. Finally, we have characterized pyruvate kinase 1 (Pyk1) as a PKA substrate, and evaluated its kinetic properties as a natural substrate. From the results obtained during this thesis, we conclude that the use of yeast permeabilized cells is the most suitable method to follow the in vivo activation of PKA. For the first time, we describe a dynamic and reversible phophorylation of the catalytic subunit. Reversible phosphorylation can thus be considered a new control mechanism for fine-tuning of PKA activity in response to environmental conditions. Finally, we show that the substrate (Pyk1) shows differential specificity and can participate in the PKA activation process depending on its structural nature.

Citación:

---------- APA ----------

Portela, Paula. (2005). Estudio in vivo del mecanismo de activación de la Proteína Quinasa dependiente de cAMP. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3799_Portela

---------- CHICAGO ----------

Portela, Paula. "Estudio in vivo del mecanismo de activación de la Proteína Quinasa dependiente de cAMP". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2005.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3799_Portela

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