Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano |
| Autor: | Abdian, Patricia |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
| Fecha de defensa: | 2005 |
| Fecha en portada: | 2005 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Director: | Ielpi, Luis |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | GLICOSILTRANSFERASA; ALFA-MANOSILTRANSFERASA; EXOPOLISACARIDO; MUTAGENESIS SITIODIRIGIDA; MODIFICACION QUIMICA; MODELADO MOLECULAR; ACETOBACTER XYLINUM; POLIPRENOL; CAZYGLYCOSYLTRANSFERASE; ALFA-MANNOSYLTRANSFERASE; EXOPOLYSACCHARIDE; SIDE-DIRECTED MUTAGENESIS; CHEMICAL MODIFICATION; MOLECULAR MODELING; ACETOBACTER XYLINUM; POLYPRENOL; CAZY |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3869_Abdian |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3869_Abdian.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3869_Abdian |
| Ubicación: | Dep.QUI 003869 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Abdian, Patricia. (2005). Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3869_Abdian |
Resumen:
Trabajos anteriores mostraron que el gen aceA está involucrado en la biosíntesis del exopolisacárido acetano producido por Acetobacter xylinum. El producto de aceA cataliza la tercer etapa en la síntesis de la unidad repetitiva heptasacarídica del acetano. En esta tesis se informa sobre la producción heteróloga y la caracterización de AceA. El producto del gen aceA fue sobreexpresado en Escherichia coli y su función fue caracterizada utilizando un ensayo de actividad desarrollado para la enzima. Se encontró que AceA se localiza en la membrana bacteriana y que la unión a la misma es determinada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. La enzima fue solubilizada y purificada a homogeneidad en presencia de detergente. Se determinaron parámetros cinéticos preliminares de la enzima purificada para lo cual fue necesario sintetizar un análogo del sustrato aceptor. AceA es una enzima que actúa con retención de la configuración, y pertenece a la familia 4 de la clasificación CAZY para la cual, al momento de escribir esta tesis, no hay información mecanística ni estructural. Identificamos una serie de residuos conservados sobre los que se realizó mutagénesis sitio-dirigida. El análisis, con un ensayo de actividad in vitro y un ensayo in vivo por complementación heteróloga, nos permitió clasificarlos en cuatro grupos según el fenotipo de las mutantes. Dos glutamatos (E287, E295) y un residuo de lisina (K211) formarían parte del sitio activo de AceA. La importancia de los residuos ácidos fue evaluada por modificación química. Este análisis mostró que al menos un residuo ácido es esencial para la actividad de AceA. A partir de los resultados de mutagénesis, proponemos que este residuo es E287. Finalmente, realizamos el modelado por homología de la estructura 3D de AceA. La superposición de residuos del sitio activo de AceA con los de la glucógeno sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la trealosa-6-P-sintasa de E. coli, reveló un alto grado de similitud y permitió validar los resultados experimentales. El modelo estructural de AceA, también ha sido de ayuda en la localización de otros aminoácidos importantes del sitio activo, en la identificación del probable sitio de unión del aceptor, y en el modo de operar de AceA en la superficie de la membrana.
Abstract:
In earlier work it was shown that the aceA gene is involved in the biosynthesis of the exopolysaccharide acetan, produced by Acetobacter xylinum. The aceA gene product catalyzes the third step in the synthesis of the heptasaccharide repeating unit of acetan. The heterologous production and characterisation of AceA is reported in this thesis. The aceA gene product was overproduced in Escherichia coli and its function was characterised using an activity assay developed for the enzyme. It was found that AceA is located in the bacterial membrane and that hydrophobic and electrostatic interactions are implicated in membrane attachment. The enzyme was solubilized and purified to homogeneity in the presence of detergent. Preliminar kinetic parameters were determined for the purified enzyme, for which it was necessary to synthesise an acceptor analogue. AceA is a retaining CAZY family 4 glycosyltransferase, for which there is no mechanistic or structural information at the time of writing. We identified a series of conserved aminoacids and performed site directed mutagenesis on them. The analysis, by both an in vitro activity assay and an in vivo rescue assay, permitted us to classify them into four groups on the basis of the mutant phenotypes. Two glutamate residues (E287, E295) and a lysine (K211) were proposed to form part of the active site. The importance of acidic residues was assessed by chemical modification. This analysis indicated that at least one acidic residue is essential for AceA activity. From the mutagenesis results, we propose that this residue is E287. Finally, we have performed homology modelling of the 3D structure of AceA. The superposition of the active site residues of AceA with those of glycogen synthase from Agrobacterium tumefaciens and trehalose-6-P-synthase from E. coli, revealed striking similarities and allowed validation of experimental data. The structural model of AceA has also been helpful to locate other important aminoacids in the active site, the probable binding site of the acceptor substrate and the function of AceA at the membrane surface.
Citación:
---------- APA ----------
Abdian, Patricia. (2005). Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3869_Abdian
---------- CHICAGO ----------
Abdian, Patricia. "Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2005.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3869_Abdian
Estadísticas:
Descargas totales desde :
Descargas mensuales
https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3869_Abdian.pdf
