Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Identificación de marcadores genéticos asociados con la resistencia a la tuberculosis y la severidad de la enfermedad en Argentina |
| Título alternativo: | Identification of genetic markers associated with resistance to tuberculosis and disease severity in Argentina |
| Autor: | Rolandelli, Agustín |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
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| Publicación en la Web: | 2022-03-29 |
| Fecha de defensa: | 2017-12-15 |
| Fecha en portada: | 2017 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | García, Verónica Edith |
| Consejero: | Scolaro, Luis |
| Jurado: | Sasiain, María del Carmen; Ramhorts, Rosanna; Ritacco, Viviana G. |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | TUBERCULOSIS; MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS; POLIMORFISO DE NUCLEOTIDO SIMPLE; CITOQUINAS; ESTUDIO CASO-CONTROL; IL-17F; IFN-GAMMA; IL-17ATUBERCULOSIS; SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHIS; CASE-CONTROL STUDY; IL-17A; IFN-GAMMA; IL-17F |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6417_Rolandelli |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6417_Rolandelli.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6417_Rolandelli |
| Ubicación: | Dep.QUI 006417 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Rolandelli, Agustín. (2017). Identificación de marcadores genéticos asociados con la resistencia a la tuberculosis y la severidad de la enfermedad en Argentina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6417_Rolandelli |
Resumen:
La tuberculosis (TB), enfermedad causada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis (Mtb), continúa siendo un importante problema para la salud pública a pesar de la existencia de programas nacionales e internacionales de control de la enfermedad. Ha sido demostrado que los factores genéticos contribuyen al desarrollo de la TB, con una heredabilidad (proporción de la variación fenotípica en una población atribuible a componentes genéticos) estimada que oscila entre el 36% y el 70%. Identificar el rol de los factores genéticos en la resistencia/susceptibilidad a la TB podría contribuir al desarrollo de medidas preventivas y terapias genotípicas-específicas, optimizando la respuesta inmune frente a Mtb. El enfoque más ampliamente empleado para investigar la susceptibilidad genética a la TB es mediante estudios de asociación de genes candidatos. Los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) son la “marca genética de susceptibilidad” elegida en estudios de caso-control. Teniendo en cuenta la importancia de las citoquinas IL-17A e IFN-γ en la respuesta inmune frente a Mtb, en el presente trabajo de tesis se estudió la asociación de los SNPs rs2275913 (G→A) del gen de la IL-17A, rs1861494 (G→A) del gen del IFN-γ y rs763780 (T→C) del gen de la IL-17F (otra citoquina del perfil Th17, con alta similitud a la IL-17A) con la susceptibilidad a la TB y con la severidad de la enfermedad. La genotipificación de las poblaciones de pacientes con TB y de individuos sanos (DS) se realizó mediante la técnica de PCR alelo específica (ARMS-PCR). Se evaluó además el impacto que dichos polimorfismos podrían tener en la respuesta inmune del hospedador. Para esto, células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de individuos portadores de las distintas variantes de los SNPs fueron estimuladas con un lisado de Mtb y se midieron diferentes parámetros inmunológicos. También se estudió la asociación con parámetros clínicos de severidad de la TB. Se demostró que el alelo A y el genotipo GA y AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A se encuentran sub-presentados en la población de pacientes con TB, indicando que este SNP podría ser considerado como un marcador de resistencia a la TB. Más aún, estimulando CMSP de DS con un lisado de Mtb, se detectó la mayor producción de IL-17A e IFN-γ en sobrenadantes de cultivo, los porcentajes más altos de células T CD4+ productoras de estas citoquinas, la mayor expresión del receptor SLAM y el índice de proliferación más alto en los individuos portadores del genotipo AA, en comparación con los individuos portadores del genotipo GG. Estos resultados indican que los DS portadores del genotipo AA montarían una respuesta inmune más efectiva frente a un primer contacto con la bacteria. Dentro de la población de pacientes con TB, se identificó que el alelo A y el genotipo AA estaban sobre-representados en la sub-población de pacientes bajos respondedores (BR), individuos con una respuesta inmune pobre contra Mtb. A su vez, se observó que las CMSP estimuladas de estos pacientes presentaban los mayores niveles de IL-17A y los menores de IFN-γ secretados en sobrenadantes de cultivos, el mayor porcentaje de células T CD4+ productoras de IL-17A, la menor expresión de SLAM en sus linfocitos T CD3+ y el menor índice de proliferación en comparación con los pacientes portadores del genotipo GG, parámetros inmunológicos asociados con mayor severidad de la TB. De hecho, se encontró una asociación entre los pacientes portadores del genotipo AA y parámetros clínicos de mayor severidad de la TB (mayor número de bacilos en esputo y las lesiones radiológicas de pulmón más severas). Así, se propone al genotipo AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A como un marcador de resistencia a la TB y de mayor severidad de la enfermedad en Argentina. El estudio caso-control realizado para analizar la asociación entre el SNP rs1861494 del gen del IFN-γ y la TB reveló que el alelo A y el genotipo AA se encuentran sub-representados en la población de pacientes con TB, sugiriendo que este SNP podría ser considerado como un marcador de resistencia a la TB. De hecho, se encontró que las CMSP estimuladas con un lisado de Mtb de DS portadores del genotipo AA secretaban los mayores niveles de IFN-γ y tenían los porcentajes más altos de linfocitos T CD4+ productores de esta citoquina, crucial en la respuesta inmune del hospedador contra la bacteria. Sin embargo, dentro de la población de pacientes con TB no se observaron diferencias en ninguno de los parámetros inmunológicos medidos entre pacientes portadores de las distintas variantes del SNP. Tampoco se evidenció asociación entre el SNP y parámetros clínicos de severidad de la enfermedad. Así, se propone al alelo A y al genotipo AA del SNP rs1861494 del gen del IFN-γ como marcadores de resistencia a la TB, sin relación con la severidad de la enfermedad en Argentina. Por último, se estudió la relación entre el SNP rs763780 del gen de la IL-17F y la TB. Se encontró al alelo C y a los individuos portadores de este alelo (TC/CC) sobre-representados en la población de pacientes con TB, sugiriendo que este SNP podría ser considerado como un marcador de susceptibilidad a la TB. En concordancia con estos resultados, se observó que las CMSP estimuladas de DS portadores del alelo C presentaban el menor porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFN-γ , la menor expresión de SLAM en linfocitos T CD3+ y el menor índice de proliferación en respuesta al lisado de Mtb, indicado que estos individuos montarían una respuesta inmune más pobre frente a un primer contacto con la bacteria. Interesantemente, se observó una mayor secreción de IL-17F por parte de CMSP estimuladas de DS en comparación con los pacientes con TB, sin encontrarse diferencias entre los individuos portadores de las distintas variantes del SNP. Más aún, se detectaron los menores niveles de IL-17F en pacientes BR, sugiriendo que esta citoquina cumpliría un rol en la respuesta inmune generada contra Mtb. Además, dentro de la población de pacientes con TB, se identificó que el alelo C y los individuos portadores de este alelo estaban sobre-representados en la sub-población de pacientes BR. También, se detectaron los menores niveles de IFN-γ y los mayores de IL-17A en sobrenadantes de cultivo, el mayor porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IL-17A y el menor índice de proliferación en las CMSP estimuladas de pacientes portadores del alelo C en comparación con los pacientes TT, parámetros inmunológicos asociados con mayor severidad de la TB. Asimismo, se evidenció que la mayoría de los pacientes portadores del alelo C presentaban un mayor número de bacilos en esputo en relación con los pacientes TT. Por esto, se propone al alelo C del SNP rs763780 del gen de la IL-17F como un marcador de susceptibilidad y de mayor severidad de la TB en Argentina. En conclusión, la identificación del genotipo AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A y del genotipo AA del SNP rs1861494 del gen del IFN-γ como marcadores de resistencia a la TB; del alelo C del SNP rs763780 del gen de la IL-17F como un marcador de susceptibilidad a la TB; y el rol demostrado de estas citoquinas en la inmunología de la enfermedad podrían contribuir al diseño de vacunas más efectivas y a identificar sub-poblaciones de riesgo a contraer la enfermedad en Argentina. Además, la asociación del genotipo AA del SNP rs2275913 y del alelo C del SNP rs763780 con una mayor severidad de la TB en los pacientes de Argentina podría utilizarse en la implementación de estrategias de tratamiento paciente-específica.
Abstract:
Tuberculosis (TB), a disease caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis (Mtb), continues to be a major public health problem despite the existence of national and international disease control programs. It has been demonstrated that genetic factors contribute to the development of TB, with an estimated heritability (the proportion of variation in a phenotypic trait in a population that is due to genetic variation between individuals) ranging from 36% to 70%. Identifying the role of genetic factors in resistance/susceptibility to tuberculosis might contribute to the development of preventive strategies and genotypic-specific therapies that improve the immune response against Mtb. The most widely approach used to investigate the genetic susceptibility to TB is by candidate gene association studies. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the "genetic susceptibility mark" chosen in case-control studies. Taking into account the importance of the IL-17A and IFN-γ cytokines in the immune response against Mtb, in the present investigation we studied the association of the IL-17A rs2275913 (G→A) SNP, the IFN-γ rs1861494 (G→A) SNP and the IL-17F (another TH17 cytokine, with high similarity to IL-17A) rs763780 (T→C) SNP with the susceptibility to TB and the severity of the disease. Genotyping of TB patients and healthy individuals (HD) populations was performed using the Amplification-refractory mutation system PCR (ARMS-PCR) technique. In addition, the impact of these polymorphisms on the host immune response was evaluated. To do this, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from individuals carrying the different SNP variants were stimulated with a Mtb lysate and different immunological parameters were studies. Besides, the association with clinical parameters related to TB severity was also analyzed. The A allele and the GA and AA genotype of the IL-17A rs2275913 SNP were shown to be at lower proportion in the TB patient population, indicating that this SNP could be considered as a marker of TB resistance. Furthermore, as compared to HD carrying the GG genotype, AA individuals displayed the highest production of IL-17A and IFN-γ in culture supernatants, the highest percentages of CD4+ T cells producing these cytokines, the highest SLAM expression and the highest proliferation index measured in Mtb-stimulated PBMCs. These findings indicate that AA HD would mount a more effective immune response against Mtb at a first contact. Within the TB patient population, the A allele and the AA genotype were identified in a higher proportion in the sub-population of low responder (LR) patients, individuals with a poor immune response against Mtb. In fact, Mtb-stimulated PBMCs of these patients displayed the highest levels of IL-17A and the lowest of IFN-γ in culture supernatants, the highest percentage of IL-17A-producing CD4+ Tcells, the lowest expression of SLAM in their CD3+ T lymphocytes and the lower proliferation index, immunological parameters associated with greater TB severity, compared to patients carrying the GG genotype. Moreover, an association between patients with AA genotype and clinical parameters of grater TB severity (higher number of sputum bacilli and more severe radiological lesions) was detected. Thus, the IL-17A rs2275913 AA genotype is proposed as a marker of TB resistance, but also related to higher disease severity in Argentina. The case-control study analyzing the association between the IFN-γ rs1861494 SNP and TB revealed that the A allele and AA genotype were at a lower proportion in the TB patients population, suggesting that this SNP could be considered as a marker of TB resistance. In fact, Mtb-stimulated PBMCs from HD carrying the AA genotype displayed the highest levels of IFN-γ and the highest percentages of CD4+ T cells producing this cytokine, which is crucial in the host's immune response against the bacterium. However, within the TB population, no differences were observed in any of the immunological parameters measured among patients carrying different SNP variants. Besides, there was no association between the SNP and clinical parameters of the disease severity. Thus, the A allele and the AA genotype of the IFN-γ rs1861494 SNP are proposed as TB resistance markers, with no association with the severity of the disease in Argentina. Finally, the association between the IL-17F rs763780 SNP and TB was studied. The C allele and individuals carrying this allele (TC/CC) were found in a higher proportion in the TB patient population, suggesting that this SNP could be considered as a marker of TB susceptibility. In agreement with these results, it was observed that Mtb-stimulated PBMCs carrying the C allele displayed the lowest percentage of CD4+ T cells producing IFN-γ , the lowest SLAM expression in CD3+ T lymphocytes and the lowest proliferation index in response to Mtb lysate, indicating that HD carrying the C allele would mount a poorer immune response against the bacterium. Interestingly, Mtb-stimulated PBMCs from HD showed increased secretion of IL-17F in comparison with TB patients, with no differences detected among individuals carrying the different SNP variants. Moreover, lower levels of IL-17F were detected in LR patients, suggesting that this cytokine would play a role in the immune response generated against Mtb. In addition, within the TB patient population, the C allele and individuals carrying this allele were found in a higher proportion at the sub-population of LR patients. Furthermore, lower levels of IFN-γ and higher levels of IL-17A were detected in culture supernatants of Mtb-stimulated PBMCs from TB patients carrying the C allele, with the highest percentage of IL-17A producing CD4+ T cells and the lowest proliferation index. Besides, it was evidenced that the majority of the TB patients carrying the C allele had a greater number of sputum bacilli as compared to TT patients. Therefore, the C allele of the IL-17F rs763780 SNP is proposed as a marker of TB susceptibility, and related to higher disease severity in Argentina. In conclusion, the identification of the AA genotype of the IL-17A rs2275913 SNP and the AA genotype of the IFN-γ rs1861494 SNP as TB resistance markers; the C allele of the IL-17F rs763780 SNP as a marker of TB susceptibility; and the demonstrated role of these cytokines in the immunology of the disease could contribute to the design of more effective vaccines and to identify sub-populations at risk of developing the disease in Argentina. In addition, the association of the AA genotype of the IL-17A rs2275913 SNP and the C allele of the IL-17F rs763780 SNP with a higher TB severity in Argentine patients could be useful in the implementation of new patient- specific treatment strategies.
Citación:
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Rolandelli, Agustín. (2017). Identificación de marcadores genéticos asociados con la resistencia a la tuberculosis y la severidad de la enfermedad en Argentina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6417_Rolandelli
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Rolandelli, Agustín. "Identificación de marcadores genéticos asociados con la resistencia a la tuberculosis y la severidad de la enfermedad en Argentina". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6417_Rolandelli
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