Estudio de las bases moleculares de las enfermedades congénitas de glicosilación humanas de tipo I y IIb usando levaduras de fisión como modelo experimental

Gallo, Giovanna Lucrecia

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Estudio de las bases moleculares de las enfermedades congénitas de glicosilación humanas de tipo I y IIb usando levaduras de fisión como modelo experimental
Título alternativo:	Study of the molecular basis of human congenital disorders of glycosylation type I and IIb using fission yeast as experimental model
Autor:	Gallo, Giovanna Lucrecia
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Fundación Instituto Leloir - CONICET. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA)
Publicación en la Web:	2022-04-05
Fecha de defensa:	2018-12-14
Fecha en portada:	2018
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Director:	D'Alessio, Cecilia
Consejero:	Wappner, Pablo
Jurado:	Daniotti, José L.; Portela, Paula; Cerdán, Pablo
Idioma:	Español
Palabras clave:	N-GLICOSILACION; LEVADURAS; OLIGOSACARILTRANSFERASA; GLUCOSIDASA I; DESORDENES CONGENITOS DE GLICOSILACIONN-GLYCOSYLATION; YEAST; OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE; GLUCOSIDASE I; CONGENITAL DISORDERS OF GLYCOSYLATION
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6545_Gallo
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6545_Gallo.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6545_Gallo
Ubicación:	Dep.BIO 006545
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Gallo, Giovanna Lucrecia. (2018). Estudio de las bases moleculares de las enfermedades congénitas de glicosilación humanas de tipo I y IIb usando levaduras de fisión como modelo experimental. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6545_Gallo

Resumen:

Los desórdenes congénitos de glicosilación (CDG) son un grupo de enfermedades hereditarias humanas debidas a defectos en la glicosilación en las células. De ellas, más de 50 son debidas a defectos en la N-glicosilación. La N-glicosilación de proteínas en el retículo endoplásmico (RE) consiste en la transferencia en bloque de un glicano Glc3Man9GlcNAc2 desde un derivado lipídico (Dol-PP-glicano) a las proteínas nacientes y es catalizada por la oligosacariltransferasa (OST). Los glicanos unidos a las proteínas (N-glicanos) facilitan su plegamiento ya que aportan grupos voluminosos hidrofílicos que mantienen en solución a los intermediarios de plegamiento. Posteriormente, los N-glicanos son modificados por glucosidasas, dando inicio al “control de calidad de plegamiento de glicoproteínas del RE” (QC). Las CDG pueden ser de tipo I y II. Las CDG de tipo I son causadas por defectos antes y durante la transferencia del glicano a las proteínas, donde la transferencia ineficiente por parte de la OST resulta en proteínas hipoglicosiladas. Las CDG de tipo II son debidas a defectos después de la transferencia del glicano, durante su remodelación, produciendo estructuras aberrantes. Para estudiar la influencia de la estructura del glicano en la eficiencia de la transferencia a proteínas por la OST, en este trabajo se determinó el grado de hipoglicosilación de un conjunto de 16 levaduras de fisión Schizosaccharomyces pombe mutantes que sintetizan todas las combinaciones de Dol-PP-glicanos posibles en la membrana del RE, simulando los defectos que se producen en las CDG de tipo I. Mediante un biosensor que consiste en una GFP que pierde la fluorescencia cuando se glicosila, se determinó que la ausencia de los residuos de glucosa es mas crítica que la de residuos de manosa en la estructura del glicano para su reconocimiento y transferencia por parte de la OST. La mutante que presentó el mayor grado de hipoglicosilación fue la que sintetiza Man9GlcNAc2. Estos resultados fueron validados por un estudio glicoproteómico donde se analizaron proteínas endógenas de la pared de S. pombe. Además, se determinó que la estructura final de un glicano que se transfiere truncado permanece incompleta. Estos resultados brindan un marco para predecir la severidad de las CDG de tipo I. Por otro lado, se reprodujeron en S. pombe los defectos genéticos de la CDG-IIb (también conocida como MOGS-CDG) debidos a mutaciones en la glucosidasa I (GI). Se observó que esta mutante crece muy lentamente y tiene un metabolismo y una capacidad replicativa muy bajos. Este fenotipo se suprimió mediante una mutación adicional en el gen alg10 (no se agrega la glucosa más externa y se sintetiza Glc2Man9GlcNAc2). Estos resultados indicarían que la acumulación de proteínas con N-glicanos triglucosilados, el sustrato de GI, sería la responsable del severo defecto observado en la CDG-IIb, si bien dicha acumulación no inhibió la actividad de la OST por producto. Por otro lado, el fenotipo observado en las mutantes no se debería tampoco a la imposibilidad de las glicoproteínas de ingresar al QC ni a una posible degradación limitada de sus glicoproteínas mal plegadas. Nuestro trabajo aporta nueva información para la comprensión de las bases moleculares de las CDG humanas de tipo I y IIb.

Abstract:

The congenital disorders of glycosylation (CDG) are a group of inherited human diseases produced by defects in glycosylation process within the cell. Among them, more than 50 are produced by defects in N-glycosylation. Protein N-glycosylation in the endoplasmatic reticulum (ER) starts with the transfer en block of a glycan Glc3Man9GlcNAc from a dolicol derivative (Dol-PP) (Dol-PP-glycan) to nascent proteins by the oligosaccharyltransferase (OST). Glycans linked to proteins (N-glycans) facilitates its folding as it provides bulky hydrophilic groups that keep folding intermediates in solution. Then, N-glycans are modified by glucosidases, allowing glycoproteins entrance to the “ER quality control of glycoprotein folding” (QC). CDG can be of type I and type II. Type I CDG are caused by defects before and during glycan transfer to proteins: inefficient transfer by OST results in hypoglycosylated proteins. Type II CDG are due to defects after glycan transfer and during its remodeling, producing aberrant N-glycan structures. To study the influence of glycan structure on the efficiency of its transfer to proteins by the OST, we determined the degree of hypoglycosylation produced in a set of 16 fission yeast Schizosaccharomyces pombe mutants that synthesize all possible combinations of Dol-PP-glycan structures in the ER membrane, mimicking type I CDG defects. Using as a biosensor a mutated GFP that loses fluorescence when it is N-glycosylated, we determined that the absence of glucose residues is more critical than that of mannose residues in the glycan structure for its efficient transfer by OST. The mutant that showed the highest degree of hypoglycosylation was the one that synthesizes Man9GlcNAc2. These results were validated by a glycoproteomic analysis in which we analyzed the hypoglycosylation of endogenous cell wall glycoproteins of all S. pombe mutants. In addition, we determined that the final structure in the cell wall of a glycan that is transferred truncated remains incomplete. These results provide a framework to predict the severity of type I CDG. On the other hand, we reproduced in S. pombe the genetic defects produced in CDG-IIb (also known as MOGS-CDG) due to mutations in glucosidase I (GI). The mutant grows very slowly and has a very low metabolism and replicative capacity. This phenotype was suppressed by an additional mutation in the alg10 gene (this mutant lacks the glucosyltransferase that adds the outermost glucose and synthesizes Glc2Man9GlcNAc2). These results would indicate that the accumulation of the substrate of GI, i.e. proteins bearing triglucosylated N-glycans, would be responsible of the severe defect observed in the CDG-IIb, although this accumulation did not inhibit the activity of OST by product. Moreover, the observed phenotype in the mutants would not be due either to hindrance of glycoproteins to enter the QC, nor to a possible limited degradation of misfolded glycoproteins. Our work provides new information in the understanding of the molecular bases of human CDG type I and IIb.

Citación:

---------- APA ----------

Gallo, Giovanna Lucrecia. (2018). Estudio de las bases moleculares de las enfermedades congénitas de glicosilación humanas de tipo I y IIb usando levaduras de fisión como modelo experimental. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6545_Gallo

---------- CHICAGO ----------

Gallo, Giovanna Lucrecia. "Estudio de las bases moleculares de las enfermedades congénitas de glicosilación humanas de tipo I y IIb usando levaduras de fisión como modelo experimental". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2018.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6545_Gallo

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